Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Slider mit drei angezeigten Artikeln pro Slide.Verwenden Sie die Schaltflächen „Zurück“ und „Weiter“, um durch die Folien zu navigieren, oder die Schaltflächen des Schiebereglers am Ende, um durch die einzelnen Folien zu navigieren.Christopher JH Davitt, Stephanie Longet, … Ed C. LavelleRobert T. Patry, Martin Stahl, … Christine M. SzymanskiDavid Poncet, Catherine Hessler, … Mark T. OrrTim Rollenske, Sophie Burkhalter, … Andrew J. MacphersonAlla Amcheslavsky, Aaron L. Wallace, … Yang WangJoel B. Heim, Vesna Hodnik, … Ute KrengelRajesh Vij, Zhonghua Lin, … James T. KoerberHong Liang, David Poncet, … Mark T. OrrDelphine L. Lauté-Caly, Emma J. Raftis, … Imke E. MulderWissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 4305 (2023) Diesen Artikel zitierenDie B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) ist ein potenter Immunmodulator, der in der Entwicklung von Schleimhautimpfstoffen und Immuntherapeutika verwertet werden kann.Um die Charakterisierung der pleiotropen biologischen Funktionen von CTB und seinen Varianten zu unterstützen, haben wir ein Panel von monoklonalen Anti-CTB-Antikörpern (mAbs) generiert.Mittels ELISA und Oberflächenplasmonresonanz wurden zwei mAbs, 7A12B3 und 9F9C7, auf ihre Bindungsaffinitäten zu Cholera-Holotoxin (CTX), CTB und EPICERTIN analysiert: eine rekombinante CTB-Variante mit Schleimhautheilungsaktivität.Sowohl 7A12B3 als auch 9F9C7 banden effizient an CTX, CTB und EPICERTIN mit Gleichgewichtsdissoziationskonstanten bei niedrigen bis subnanomolaren Konzentrationen, banden aber schwach, wenn überhaupt, an die hitzelabile Enterotoxin-B-Untereinheit von Escherichia coli.In einem zyklischen Adenosinmonophosphat-Assay unter Verwendung von menschlichen Caco2-Kolonepithelzellen wurde festgestellt, dass der 7A12B3-mAb ein potenter Inhibitor von CTX ist, während 9F9C7 eine relativ schwache inhibitorische Aktivität aufwies.Unterdessen wies der 9F9C7-mAb CTB und EPICERTIN, die an die Oberfläche von Caco2-Zellen und Milzleukozyten der Maus gebunden waren, mittels Durchflusszytometrie effektiv nach.Unter Verwendung von 9F9C7 in der Immunhistochemie bestätigten wir die bevorzugte Lokalisation von EPICERTIN in Dickdarmkrypten nach oraler Verabreichung des Proteins bei Mäusen.Zusammen bieten diese mAbs wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der biologischen Funktionen und der präklinischen Entwicklung von CTB-Varianten.Choleratoxin B-Untereinheit (CTB, ca. 58 kDa) ist eine nicht toxische Komponente des Choleratoxins (CTX), das von Vibrio cholerae freigesetzt wird, einem gramnegativen Bakterium, das starken sekretorischen Durchfall verursacht1.CTB ist ein wirksamer Immunmodulator, der aus fünf identischen Polypeptidketten besteht, die nicht kovalent in einer ringförmigen pentameren Struktur verbunden sind, die die CTX-Bindung an den Monosialogangliosid-GM1-Rezeptor vermittelt2,3,4.CTB wurde in verschiedenen rekombinanten Expressionsplattformen als Modellimpfstoffe hergestellt5,6,7,8, da es eine starke Immunantwort induziert, die durch neutralisierende Antikörper gegen CTX durch orale Verabreichung gekennzeichnet ist9,10.CTB wurde auch als molekulares Gerüst für die Immunisierung11,12 und zur Induktion einer peripheren (oralen) immunologischen Toleranz verwendet, um Allergien und verschiedene Autoimmunerkrankungen wie experimentelle autoimmune Enzephalitis (EAE), Diabetes, Arthritis und Uveitis auf Antigen-spezifische Weise zu unterdrücken13 ,14,15,16,17.CTB gilt als Schleimhaut-Immunmodulator, der eine starke Schleimhaut-IgA-Antwort induziert, während es die systemischen T-Helfer-Antworten (TH1, TH2 und TH17) durch die Induktion von Interleukin-10 (IL-10) und transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-) zu unterdrücken scheint. β)-vermittelte regulatorische T (Treg)-Zell-Induktion und -Suppression von proinflammatorischem IL-618, obwohl der genaue Mechanismus hinter einer solchen Immunmodulation schwer fassbar bleibt.Die pleiotropen Funktionen von CTB wurden kürzlich durch die Konstruktion von CTB-Varianten mit neuartigen biologischen Aktivitäten erweitert, einschließlich einer aus Pflanzen hergestellten CTB-Variante, die mit einer C-terminalen Hexapeptidverlängerung modifiziert wurde, die ein KDEL-Retentionsmotiv des endoplasmatischen Retikulums (ER) enthält19, später als EPICERTIN bezeichnet20, die eine signifikante Verbesserung der mukosalen Wundheilungsaktivität im Dickdarm zeigten21,22,23,24,25.Bei Mäusen erhöhte die orale Verabreichung von EPICERTIN spezifische Untergruppen von Immunzellpopulationen, wie Makrophagen, natürliche Killerzellen, Treg-Zellen und TH17-Zellen in der Lamina propria des Dickdarms und hochregulierte Gene des Wundheilungswegs, die durch TGF-β im Dickdarm vermittelt werden.Die schleimhautheilenden Wirkungen von EPICERTIN wurden in einem In-vivo-Dextrannatriumsulfat (DSS)-Modell für akute Colitis, einem Azoxymethan/DSS-Modell für Colitis ulcerosa und Tumorigenität21 und einem Modell für chronische Colitis-ähnliche Dickdarmentzündung, die durch wiederholte DSS-Dosen induziert wurde, bestätigt die Wundheilungseffekte wurden durch die Induktion von mukosalen Anti-CTB-Antikörpern nicht neutralisiert24.Die verlängerte Verweildauer von EPICERTIN im ER durch Interaktion mit dem KDEL-Rezeptor scheint eine entfaltete Proteinantwort auszulösen, die zur Aktivierung der TGF-β-Signalübertragung und Transkription von Genen des Wundheilungswegs in Dickdarmepithelzellen führt23.Die schleimhautheilenden Wirkungen könnten jedoch auch aus der Modulation von Schleimhautimmunzellen stammen.Tatsächlich berichteten frühe Studien über mehrere Rollen von CTX und CTB in Leukozyten von Mäusen und Menschen.Zum Beispiel hemmte CTB die durch Mitogene (z. B. Concanavalin A) und Antigene induzierte T-Zell-Proliferation26, und Antigen-konjugiertes CTB förderte seine Präsentation und senkte die für die T-Zell-Aktivierung erforderliche Antigenschwelle27.Um die Untersuchung der Mechanismen hinter den biologischen Aktivitäten von EPICERTIN und anderen von CTB abgeleiteten Molekülen zu erleichtern, zielten wir daher darauf ab, zwei monoklonale Antikörper (mAbs) zu charakterisieren, die gegen CTB erzeugt wurden, um die Untersuchung dieser Proteine ​​zu unterstützen.Hier berichten wir über die Isolierung und Charakterisierung von zwei mAbs, 7A12B3 und 9F9C7, die gegen CTB generiert wurden, und demonstrieren ihre einzigartigen und unterschiedlichen Bindungsprofile mittels ELISA, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)28 und Assays mit zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP). .Außerdem zeigen wir die Nützlichkeit dieser mAbs bei der Neutralisierung von CTX und dem Nachweis von CTB, das sowohl an murine Leukozyten durch Durchflusszytometrie als auch an Dickdarmgewebe durch Immunhistochemie (IHC) gebunden ist.Zusammen mit unseren früheren Studien, in denen diese mAbs in Immunfluoreszenz-, Immunpräzipitations- und pharmakokinetischen Analysen von EPICERTIN20,23 verwendet wurden, unterstreicht die vorliegende Studie, dass 7A12B3 und 9F9C7 bei der Untersuchung noch nicht charakterisierter biologischer Wirkungsmechanismen von CTB und seinen Derivaten als Kandidaten für die Schleimhaut helfen werden Impfstoffe und Immuntherapeutika.Die Immunisierung von Wistar-Ratten zur Hybridomerzeugung wurde von GenScript USA, Inc. (Piscataway, NJ) durchgeführt, während Durchflusszytometrie- und IHC-Experimente unter Verwendung von C57BL/6J-Mäusen an der University of Louisville durchgeführt wurden.Die Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee jeder Institution genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien gemeldet.Die allgemeinen Verfahren für die Tierpflege und -unterbringung in diesen Studien entsprachen den aktuellen Empfehlungen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, den aktuellen Anforderungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und den aktuellen Anforderungen wie vom US-Landwirtschaftsministerium durch den Animal Welfare Act und die Animal Welfare Regulations (Juli 2020) angegeben.Cholera-Enterotoxin (C8052), Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB; C9903) und hitzelabile Enterotoxin-B-Untereinheit (LTB; E9656) von Escherichia coli wurden von Sigma (Sigma Aldrich) bezogen.PhenoVue Fluor 594-WGA wurde von PerkinElmer (Perkin Elmer Health Science Inc. Boston MA, USA) bezogen, und Alexa Fluor 647-konjugiertes Ratten-Anti-Maus/Mensch-CD324 (E-Cadherin) (Klon DECMA-1) wurde von Biolegend bezogen.Um die Erzeugung von CTX-neutralisierenden mAbs zu erleichtern, wurde eine Asn4-glykosylierte CTB-Variante, die in Nicotiana benthamiana19,29 (gCTB) produziert wird, als Antigen für die Immunisierung verwendet.Das pflanzenexprimierte gCTB wurde durch Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von CHT-Hydroxyapatit-Chromatographie, wie zuvor beschrieben19, gereinigt.Das gereinigte Protein wurde verwendet, um Wistar-Ratten zu immunisieren, um ein Panel monoklonaler Antikörper von Genscript USA, Inc. unter Verwendung von Standard-Hybridomtechnologie zu erzeugen30,31.Kurz gesagt wurden drei Wistar-Ratten mit 50 &mgr;g Keyhole-Limpet-Hämocyanin-konjugiertem gCTB (gCTB-KLH) immunisiert und anschließend alle zwei Wochen mit 25 &mgr;g gCTB-KLH geboostert, für insgesamt drei Booster-Dosen.Zwei Wochen nach der letzten Booster-Immunisierung wurde die Lymphozytenpopulation aus Milzen isoliert und verwendet, um immortalisierte Hybridome durch Fusion mit den Sp2/0-Ag14-Myelomzellen nach Standardverfahren zu erzeugen.Hybridome wurden in Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium, ergänzt mit IL-6, gezüchtet, und die Kulturüberstände wurden auf mit CTB reaktive Abs durch Antigen-Capture-Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und GM1-Capture-ELISA gescreent.Zwei Anti-CTB-mAbs-produzierende Hybridome mit den Namen 7A12B3 und 9F9C7 wurden ausgewählt und expandiert, und mAbs wurden in Hybridom-Zellkulturüberständen unter Verwendung des In-vitro-Rollflaschen-Zellkulturverfahrens, gefolgt von Protein-G-Affinitätschromatographie-Reinigung, produziert.Mit dem Pro-Detect™ Rapid Antibody Isotyping Kit – Rat (Thermo Fisher Scientific) wurde festgestellt, dass sie beide der Unterklasse IgG2a angehören.Die Bindungsaffinitäten von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs an CTX wurden durch Antigen (CTX, CTB, LTB)-Capture-ELISA, GM1-Capture-ELISA und kompetitiven GM1-Capture-KDEL-Nachweis (GM1/KDEL)-ELISA wie zuvor beschrieben22 mit geringfügigen Modifikationen wie bestimmt folgt:ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, MaxiSorp) wurden mit 100 &mgr;l pro Vertiefung von 2 &mgr;g/ml CTB, CTX oder LTB in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert.Die Platten wurden dreimal mit PBST (PBS + 0,05 % Tween 20) gewaschen und mit 150 &mgr;l/Vertiefung Blockierungslösung (5 % fettfreie Trockenmilch in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert.Insgesamt 100 μl/Vertiefung seriell verdünnter Hybridomüberstände, beginnend bei einer Verdünnung von 1:100, oder gereinigte 7A12B3- und 9F9C7-mAbs, verdünnt in 1 % PBST (PBST mit 1 % fettfreier Trockenmilch) wurden nach dreimaligem Waschen mit PBST und hinzugefügt 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.Nach 3 Waschgängen mit PBST wurde ein mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierter Ziegen-Anti-Ratten-IgG-H&L-Antikörper (SouthernBiotech, Birmingham AL, USA), verdünnt auf 1:5000, zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.Die Platten wurden dreimal gewaschen und das Enzymsubstrat Tetramethylbenzidin (TMB, 100 µL/Vertiefung) wurde hinzugefügt und für 2–3 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion mit 100 µl/Vertiefung 0,6 N H2SO4-Stopplösung gestoppt wurde.Die Absorption bei 450 nm wurde unter Verwendung eines BioTek Synergy HT-Mikroplattenlesegeräts (Winoski, VT, USA) gemessen.ELISA-Platten wurden mit 100 &mgr;l pro Vertiefung von 2 &mgr;g/ml Monogangliosid GM1 (SIGMA-Aldrich), verdünnt in PBS, beschichtet.Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal mit PBST gewaschen und mit 150 μl/Well Blockierungslösung über Nacht (12–16 h) bei 4 °C blockiert.Die Platten wurden 3 × mit PBST gewaschen und eine festgelegte Konzentration (0,3 &mgr;g/ml) von CTB in 1 % PBSTM wurde auf die Platten aufgetragen und bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert.Nach dem Waschen mit PBST wurden Verdünnungen von Hybridomüberständen oder gereinigten mAbs in 1 % PBSTM zugegeben und die gebundenen Antikörper wie oben beschrieben nachgewiesen.ELISA-Platten wurden mit GM1 beschichtet und wie oben beschrieben blockiert.Nach dreimaligem Waschen der Platten mit PBST wurden 50 µl/Vertiefung mAbs mit 0, 0,1, 0,3 oder 1 µg/ml und 50 µl/Vertiefung 2-fach seriell verdünntes EPICERTIN (beginnend mit 2 µg/ml), beide vorbereitet in 1 % PBSTM, wurden gleichzeitig auf die Platten gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.Nach dem Waschen mit PBST wurden 100 &mgr;l/Vertiefung Maus-Anti-KDEL-mAb (Enzo LifeSciences; Farmingdale, NY, USA), verdünnt 1:1000 in 1% PBSTM, zugegeben, und die Platten wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.Die Platten wurden gewaschen und Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (SouthernBiotech), verdünnt 1:5000 in 1 % PBSTM, wurde zugegeben, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde.Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde die HRP-Enzymaktivität wie oben beschrieben gemessen.ELISA-Platten wurden mit GM1 beschichtet, blockiert und wie oben beschrieben gewaschen.Getrennt davon wurden gleiche Volumina von zweifach seriell verdünnten mAbs (ab 8 µg/ml) und EPICERTIN in einer festen Konzentration (0,2 µg/ml), beide in 1 % PBSTM zubereitet, gemischt und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert eine unverbindliche Rundbodenplatte.Dann wurden mAb-EPICERTIN-Mischungen zu den GM1-beschichteten Platten (100 &mgr;l/Vertiefung) gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h.Das plattengebundene EPICERTIN wurde wie oben beschrieben nachgewiesen.Die Bindungsaffinitäten von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs an CTX, kommerzielles CTB und EPICERTIN wurden auch durch Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) unter Verwendung des Biacore Gold Seal T200 (GE Healthcare) bestimmt, das wie zuvor beschrieben mit einem CM5-Sensorchip ausgestattet war19.Die Liganden 7A12B3 (150 kDa) und 9F9C7 (150 kDa) mAbs wurden auf der carboxylierten Dextranmatrix einer CM5-Chipsensoroberfläche unter Verwendung von Aminkopplungschemie immobilisiert.Die Oberflächen der Durchflusszellen wurden mit einer 1:1-Mischung aus 0,1 M NHS (N-Hydroxysuccinimid) und 0,4 M EDC (3-(N,N-Dimethylamino)propyl-N-ethylcarbodiimid) bei einer Flussrate von 5 μl/ Minute für 14 Minuten.Die Liganden wurden in einer Konzentration von 5 μg/ml in 10 mM Natriumacetat, pH 4,0, mit einer Dichte von 205–220 RE (7A12B3) und 709 (9F9C7) immobilisiert.Die Fließzellen 1 und 3 wurden als Referenzleerzeichen belassen, während die Fließzellen 2 und 4 für die Liganden 7A12B3 und 9F9C7 verwendet wurden.Beide Oberflächen wurden mit 1 M Ethanolamin, pH 8,0, mit einer Injektionszeit von 7 min blockiert.Laufpuffer war 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % P20, pH 7,4.Um Steady-State-Daten und die kinetische Bindung der Analyten CTX, CTB und EPICERTIN an immobilisierten 7A12B3-mAb zu sammeln, wurden die Analyten auf 26,9 nM in Laufpuffer verdünnt.Für 9F9C7 wurden die Analyten CTX, CTB und EPICERTIN in Laufpuffer auf 1670 nM verdünnt.Die Proben wurden zweifach seriell verdünnt und mit einer Flussrate von 10 μl/min bzw. 30 μl/min bei 25 °C injiziert.Den Komplexen mit 7A12B3-mAb wurde erlaubt, sich für 120 s zu assoziieren und für 600 s zu dissoziieren, wohingegen man die Komplexe mit 9F9C7-mAb für 180 s assoziieren und für 900 s dissoziieren ließ.Die Oberflächen wurden mit 10 mM Glycin pH 2,0 für 30 s bzw. 60 s für 7A12B3- und 9F9C7-mAbs regeneriert.Dreifach-Injektionen (in zufälliger Reihenfolge) jeder Probe und einer Puffer-Blindprobe wurden über die beiden Oberflächen fließen gelassen.Die Daten wurden mit einer Rate von 10 Hz gesammelt.Die Daten wurden unter Verwendung der globalen Datenanalyseoption, die in der Biacore Evaluation Software verfügbar ist, an ein bivalentes Modell angepasst.Caco2-Zellen wurden in 12-Well-Clusterplatten (Thermo Scientific Nunc Cell-Culture Treated, Roskilde, Dänemark) mit einer Dichte von 7 × 105 Caco2-Zellen/Well gezüchtet, die EMEM-Medium (Gibco BRL) enthielten, ergänzt mit 20 % FBS, 5 mM HEPES , 5 mM NEAA, 5 mM Natriumpyruvat und Penicillin/Streptomycin für 24 h.Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in serumfreiem EMEM-Medium, enthaltend 2,5 mM HEPES, 0,01 % Rinderserumalbumin, 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (MP Biomedicals, LLC, Solon , Ohio) und den angegebenen Konzentrationen von 7A12B3 und 9F9C7 mAbs und 0,5 µg/ml (5,68 nM) CTX (Sigma, St. Louis, MO) oder Ratten-IgG-Isotypkontrolle für 30 min bei 4 °C (auf Eis) .Die Platten wurden anschließend für 2 h in einen Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 °C überführt.Die Kulturplatten wurden bei 1000 × g zentrifugiert, das Kulturmedium entfernt und die Zellen vor der Inkubation in 200 µl 0,1 N HCl für 20 min bei Raumtemperatur zweimal mit PBS gewaschen, um eine Zelllyse und cAMP-Extraktion zu ermöglichen32.cAMP wurde unter Verwendung eines empfindlichen kolorimetrischen ELISA-basierten Kits (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) nach den Bedingungen des Herstellers nachgewiesen.Eine Standardkurve wurde mit bekannten cAMP-Konzentrationen erstellt und die cAMP-Spiegel in den Proben (pmol/7 × 105 Caco2-Zellen) wurden gemäß der durch die Standardkurve erzeugten Gleichung bestimmt.Weibliche C57BL/6J-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten und im Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet.Die Milzen von zwei naiven Mäusen wurden gesammelt und zerkleinert, und die Zellsuspension wurde nach Behandlung mit ACK-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen durch ein 40-&mgr;m-Zellsieb geleitet.Die Zellen wurden gezählt, die Fc-Rezeptoren mit Maus-γ-Globulinen (20 µg/mL) blockiert und die Zellen anschließend mit EPICERTIN oder einer EPICERTIN-Variante mit Gly33 → Asp-Mutation (EPICERTING33D; 23 5 µg/mL) für 30 inkubiert Minute auf Eis.Nach zwei Waschgängen mit FACS-Puffer wurde unmarkierter 9F9C7-mAb mit 5 &mgr;g/ml zugegeben und die Zellsuspension 30 min auf Eis inkubiert.Später wurde ein FITC-konjugierter Ziegen-anti-Ratten-IgG (Poly4054)-Antikörper hinzugefügt, gefolgt von Waschen und Inkubation mit Fluorochrom-markierten Antikörpern gegen zellspezifische Marker, einschließlich PE-konjugiertem Ratten-anti-CD4 (RM4-5), PE-konjugiertem Ratten-anti -IA-IE (M5/114.15.6), PE-konjugiertes Ratten-anti-Ly6C (Hk1.4), PE-konjugiertes Ratten-anti-Gr-1 (RB6-8C5), PE- oder APC-konjugiertes armenischer Hamster-anti-CD11c (N418), APC-konjugiertes Ratten-anti-CD8a (53-6.7), APC-konjugiertes Ratten-anti-CD11b (M1/70), APC-konjugiertes Ratten-anti-Ly6G (1A8), APC-konjugiertes Ratten-anti-F4/80 (BM8) und PE- oder APC-konjugierte Ratten-IgG2a-κ-Isotyp-Kontrollantikörper (RTK2758), alle von Biolegend.APC-konjugiertes Ratten-Anti-CD19 (1D3) stammte von eBioscience.Die durchflusszytometrische Analyse wurde auf einem FACSCalibur oder einem BD SLRFortessa (BD Biosciences) durchgeführt und die Daten wurden mit der Software FlowJo_v10.8.0_CL verarbeitet.Die durch den sekundären Ziegen-anti-Ratten-IgG-Antikörper erzeugten geometrischen Mittelwerte der Fluoreszenzintensität wurden von denen des 9F9C7-anti-CTB-spezifischen mAb subtrahiert.Die Verfahren mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Louisville genehmigt.EPICERTIN in PBS (3 μg/100 μl) wurde fünf weiblichen C57BL/6 J-Mäusen nach Neutralisation der Magensäure mit 200 μl Natriumbicarbonat (30 mg/ml) per Schlundsonde verabreicht.Die Mäuse wurden nach 0, 3, 6, 12 oder 24 h getötet, und die Dickdarmgewebe wurden mit PBS gewaschen und in OCT-Verbindung eingebettet, um 7 &mgr;m dicke gefrorene Schnitte herzustellen.Kryoschnitte des Dickdarmgewebes wurden in 100 % Methanol bei –20 °C für 3 min fixiert, getrocknet und mit 10 % FBS in PBS mit 20 μg/ml Maus-γ-Globulinen für 1 h bei RT blockiert.Die Gewebeschnitte wurden mit 5 μg/ml Pheno Vue Fluor 594-WGA (PerkinElmer Health Sciences), 2 μg/ml Anti-E-Cadherin und 2 μg/ml Anti-CTB (9F9C7 mAb) für 1 h bei RT gefärbt.Die Objektträger wurden in PBS gewaschen, Bilder wurden mit einem konfokalen Nikon A1R-Laserscanning-Mikroskop unter Verwendung von 20-fachen und 60-fachen Vergrößerungslinsen mit geeigneten Kanälen aufgenommen, und die Daten wurden mit der Bildgebungssoftware NIS Elements verarbeitet.Die Werte der halbmaximalen effektiven Konzentration (EC50) wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung von Prism v.9.1.0 bestimmt.Einweg-ANOVA mit Mehrfachvergleichs-Posttest von Bonferroni wurde verwendet, um Absorptionswerte von cAMP-Spiegeln unter Verwendung von Prism v.9.1.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) zu analysieren.Ein Wert von p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.Drei Wistar-Ratten wurden mit einem KLH-konjugierten gCTB immunisiert.Alle Ratten zeigten nach drei Dosen des Antigens konsistent hohe Anti-CTB-Antikörpertiter im Serum, wie sowohl durch den CTB-Antigen-Capture-ELISA als auch den GM1-Capture-ELISA analysiert wurde.Angesichts der Tatsache, dass Ratte Nr. 1 ein optimales Reaktionsverhältnis für direktes vs. GM1-gebundenes CTB bei einem höheren Verdünnungsfaktor (1:243.000) zeigte, was auf einen signifikanten Anteil von Antikörpern hinweist, die auf die GM1-bindende Facette von CTB abzielen, wurde diese Ratte ausgewählt Hybridom-Generation.Insgesamt wurden 40 positive Hybridomklone erhalten.Hybridom-Überstände wurden auf das Vorhandensein von Anti-CTB-Antikörpern durch GM1-Einfang- und CTB-Antigen-Einfang-ELISAs analysiert ( 1A ).In diesem Stadium wurden die 7A12-, 8F8- und 9F9-Hybridome anfänglich basierend auf der hohen Bindungsaffinität zu immobilisiertem CTB im Antigen-Einfang-ELISA und im GM1-Einfang-ELISA selektiert.Bemerkenswerterweise zeigten unter den drei Hybridomen 7A12- und 9F9-mAb sehr unterschiedliche CTB-Bindungsmuster im ELISA ( 1B ), wo das Bindungssignal von 7A12-mAb im GM1-Capture-ELISA fast vollständig aufgehoben wurde, während 9F9-mAb ähnliche Bindungsreaktionen zeigte unabhängig von den ELISA-Formaten.Daher fuhren wir mit der Subkultivierung dieser beiden Hybridome unter einschränkenden Verdünnungsbedingungen fort, um einzelne Klone zu isolieren, und die resultierenden 7A12B3- und 9F9C7-Hybridome wurden für nachfolgende Studien ausgewählt.Das Pro-Detect™ Rapid Antibody Isotyping Kit – Ratte zeigte, dass sowohl 7A12B3- als auch 9F9C7-mAbs vom IgG2a-Isotyp mit Kappa-Leichtketten sind.Erzeugung und Screening von Hybridom-Überständen, die auf CTB reagieren.(A) Drei Wistar-Ratten wurden mit gCTB immunisiert, um ein Panel von mAbs zu erzeugen, und das Blutserum von jeder Ratte wurde verdünnt und durch Antigen-Capture- und GM1-Capture-ELISA auf die Konzentration von Anti-CTB-IgG-Antikörpern analysiert.(B) Charakterisierung von drei Hybridomen, 7A12, 8F8 und 9F9, die durch ELISA hohe Anti-CTB-Antikörperspiegel zeigten.Die Überstände der Hybridom-Zellkulturen zeigten charakteristische Bindungsmuster an CTB im Antigen-Capture- vs. GM1-Capture-ELISA.Alle drei Hybridome zeigten im CTB-Capture-ELISA eine ähnlich hohe Bindung.Im Gegensatz dazu zeigte 7A12 die geringste und vernachlässigbare Bindung, während 9F9 die höchste Bindung im GM1-Einfang-ELISA zeigte.Balken stellen Mittelwerte ± Bereich technischer Duplikatwerte dar.Um die Antigenbindungseigenschaften von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs zu bestimmen, führten wir zunächst einen Antigen-Einfang-ELISA durch, bei dem CTB, CTX und LTB auf die Platten aufgetragen wurden.Sowohl 7A12B3- als auch 9F9C7-mAbs zeigten ähnlich hohe Bindungsaffinitäten zu CTB, ausgedrückt als halbmaximale effektive Konzentrationen (EC50) von 0,028 ± 0,003 bzw. 0,036 ± 0,003 µg/ml (Abb. 2, linkes Feld).Ebenso banden 7A12B3- und 9F9C7-mAbs an CTX mit hohen Bindungsaffinitäten, dargestellt durch niedrige EC50-Werte (0,017 ± 0,003 bzw. 0,041 ± 0,005 µg/ml).Der 9F9C7-mAb zeigte eine etwas geringere Affinität zu CTX als 7A12B3, möglicherweise aufgrund einer marginalen Okklusion des Epitops durch die Holotoxin-A-Untereinheit ( 2 , mittleres Feld).Trotz der großen Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz von LTB mit CTB33,34 zeigten sowohl 7A12B3- als auch 9F9C7-mAbs eine wesentlich geringere Affinität zu LTB als zu CTB und CTX mit einem EC50-Wert von 1,109 ± 0,162 bzw. 135 ± 70 µg/ml (Abb. 2, rechte Tafel).Durchschnittliche EC50-Werte von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs, die an alle drei Moleküle binden, sind in Tabelle 1 dargestellt.Analyse der 7A12B3- und 9F9C7-mAbs, die an CTX, CTB und LTB binden, im Antigen-Capture-ELISA.ELISA-Platten wurden mit 2 &mgr;g/ml CTB, CTX oder der hitzelabilen Enterotoxin-B-Untereinheit (LTB) von Escherichia coli beschichtet.Dreifach seriell verdünnte 7A12B3- oder 9F9C7-mAbs (3000–0,051 ng/ml für CTB und CTX; 100.000–1,69 ng/ml für LTB) wurden zu den Platten gegeben und inkubiert, und plattengebundene mAbs wurden mit einer Anti-Ratte nachgewiesen IgG-Sekundärantikörper.Repräsentative Diagramme werden gezeigt.Die Assays wurden dreifach durchgeführt, und jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung.Die Daten wurden unter Verwendung der Software GraphPad Prism 9 analysiert und geplottet und aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten erhalten.Die halbmaximalen effektiven Konzentrationen (EC50s) wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse (GraphPad Prism 9) bestimmt und in Tabelle 1 dargestellt.Um die Antigenbindungsprofile von 7A12B3 und 9F9C7 weiter zu analysieren, wurde eine SPR-Analyse eingesetzt, bei der jeder mAb auf einem CM5-Sensorchip immobilisiert wurde, während CTX, CTB, EPICERTIN und LTB als lösliche Analyten verwendet wurden.Abbildung 3 zeigt repräsentative Sensorgramme.Die Analyse der Bindungskinetik ergab, dass 7A12B3 mAb eine durchschnittliche Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (kon) von 1,4 × 106 (1/Ms), eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (koff) von 1,8 × 10–4 (1/s) und ein durchschnittliches Gleichgewicht aufwies Dissoziationskonstante (KD) von 129 pM zu CTX.Dieser mAb zeigte auch eine ähnlich hohe Bindungsaffinität zu CTB und EPICERTIN mit durchschnittlichen KD-Werten von 88,9 bzw. 159 pM (Fig. 3A).Andererseits zeigte der 9F9C7-mAb im Vergleich zu 7A12B3 eine langsamere Assoziation und eine langsamere Dissoziation für CTX und CTB.Der 9F9C7-mAb zeigte auch eine langsamere Assoziation, aber eine ähnliche Dissoziation wie EPICERTIN, verglichen mit 7A12B3 (Fig. 3B).Somit stellte sich heraus, dass 9F9C7-mAbs insgesamt niedrigere Bindungsaffinitäten zu den drei Analyten aufwiesen, da 9F9C7 eine durchschnittliche KD von 6,1 nM zu CTX, 4,4 nM zu CTB und 33,2 nM zu EPICERTIN aufwies.Diese Werte entsprechen einer ungefähr 50-fachen (CTX und CTB) und 200-fachen (EPICERTIN) geringeren Affinität im Vergleich zu 7A12B3.In scharfem Gegensatz dazu zeigte keiner der mAbs eine messbare Bindung an LTB unter den in dieser SPR-Analyse verwendeten Bedingungen ( 3A , B).Durchschnittliche Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten und KD-Werte sind in Tabelle 2 zusammengefasst.SPR-Analyse von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs, die Affinitäten zu CTX, CTB, EPICERTIN und LTB binden.Jeder mAb wurde auf einem CM5-Sensorchip immobilisiert.Jeder Analyt (CTX, CTB, EPICERTIN und LTB) wurde in verschiedenen Konzentrationen (0, 1,68, 3,37, 6,73, 13,47, 26,9375 nM) gegen immobilisierten 7A12B3-mAb oder 9F9C7-mAb (0, 106,3, 212,5, 425, 850) getestet , 1670 nM).Die gesammelten kinetischen Daten wurden leer subtrahiert, sodass die Konzentration bei 0 nM nicht gezeigt wird.Repräsentative Sensorgramme für (A) 7A12B3 und (B) 9F9C7 werden nach Anpassung des bivalenten Modells gezeigt.Jedes Experiment wurde mit mindestens drei Wiederholungen durchgeführt.Zunächst wurde ein GM1-Capture-ELISA durchgeführt, um den Einfluss von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs auf die Rezeptorbindungsaktivität von CTB zu analysieren.In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen aus den Kulturüberständen der elterlichen Hybridomklone ( 1B ) blockierte der 7A12B3-mAb deutlich die Bindung von CTB an GM1, wohingegen in Gegenwart von 9F9C7-mAb keine signifikante Wirkung beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).Um die blockierenden Eigenschaften von 7A12B3-mAb bei der CTB-GM1-Interaktion genauer zu analysieren, verwendeten wir einen kompetitiven GM1/KDEL-ELISA, bei dem an den Glykosphingolipidrezeptor gebundenes EPICERTIN unter Verwendung von Anti-KDEL-mAb22 nachgewiesen wurde.Der 7A12B3-mAb bei 0,1–1 &mgr;g/ml hemmte dosisabhängig die Bindung von EPICERTIN an GM1 ( 4A , linkes Feld).Im Gegensatz dazu zeigte der 9F9C7-mAb eine relativ geringere Wirkung auf die EPICERTIN-Bindung an GM1 und verschob die EPICERTIN-Bindungskurve nur bei einer Konzentration von 1 µg/ml auf ein Niveau, das dem sehr ähnlich war, das mit 0,1 µg/ml des 7A12B3-mAb beobachtet wurde (Fig. 4A , rechte Tafel).In einem kompetitiven GM1/KDEL-ELISA, bei dem unterschiedliche Konzentrationen der jeweiligen mAbs mit einer festen Konzentration von EPICERTIN von 100 ng/ml vorinkubiert wurden, wurden die IC50-Werte für 7A12B3- und 9F9C7-mAbs bei der EPICERTIN-Bindung an GM1 mit 201,2 vs 993,7 ng/ml (Fig. 4B).Der 7A12B3-mAb, aber nicht 9F9C7, blockiert die EPICERTIN-Bindung an GM1-Gangliosid.EPICERTIN und GM1-capture KDEL-detection (GM1/KDEL) ELISA-Methoden wurden eingesetzt, um die Auswirkung von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs auf die Bindung von CTB an den Gangliosidrezeptor aufzudecken.(A) Drei Konzentrationen jedes Antikörpers (0,1, 0,3 und 1,0 μg/ml) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von EPICERTIN vorinkubiert und auf mit GM1 beschichtete ELISA-Platten aufgetragen.Plattengebundenes EPICERTIN wurde mit einem Anti-KDEL-mAb nachgewiesen, wie zuvor beschrieben22.Der 7A12B3-mAb blockierte konzentrationsabhängig die Wechselwirkung von EPICERTIN mit GM1 bei 0,1–1 µg/ml, während der 9F9C7-mAb viel geringere Wirkungen hatte.(B) Ein kompetitiver GM1/KDEL-ELISA wurde eingesetzt, um die Wirkung von mAbs auf die EPICERTIN-GM1-Wechselwirkung zu bestimmen.Unterschiedliche Konzentrationen der jeweiligen mAbs, einschließlich einer Ratten-IgG2a-Isotypkontrolle, wurden mit 100 ng/ml EPICERTIN vorinkubiert und auf mit GM1 beschichtete ELISA-Platten aufgetragen.Plattengebundenes EPICERTIN wurde wie zuvor beschrieben mit einem Anti-KDEL-mAb nachgewiesen22.Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der mAbs 7A12B3 (201,2 ng/ml) und 9F9C7 (993,7 ng/ml) wurde durch eine nichtlineare Regressionsanalyse mit GraphPad Prism 9 bestimmt. Die Daten stammen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten und sind repräsentativ Diagramm von einem Experiment wird gezeigt.Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± Bereich von doppelten Proben.Die inhibitorischen Wirkungen von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs auf die biologischen Funktionen von CTX wurden im Caco2-Zelllinienmodell von durch CTX induziertem cAMP analysiert.Abbildung 5A zeigt, dass CTX (0,5 µg/ml), vorinkubiert mit 7A12B3 mAb (1 µg/ml), im Vergleich zu CTX allein (86,7 % Hemmung; p < 0,0001) im Vergleich zu CTX allein (86,7 % Hemmung; p < 0,0001), während 9F9C7 mAb einen signifikant niedrigeren Gehalt an zytoplasmatischem cAMP in Caco2-Zellen induzierte zeigten eine signifikante, aber weniger hemmende Wirkung (62,6 % Hemmung; p = 0,0032).Die inhibitorische Wirkung von 7A12B3-mAb war signifikant verschieden von der von 9F9C7-mAb (p = 0,0274) oder einer Ratten-IgG2a-Isotypkontrolle (p = 0,0002).Die marginale Hemmung, die mit einem Ratten-IgG2a-Isotyp-Kontrollantikörper beobachtet wurde, war gegenüber der PBS-Vehikelkontrolle nicht statistisch signifikant (p = 0,0626).Die inhibitorischen Wirkungen von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs auf die CTX-induzierte Erhöhung von cAMP in Caco2-Zellen waren konzentrationsabhängig ( 5B ).Wenn CTX mit 1 µg/ml mAbs co-inkubiert wurde, hemmte 7A12B3 die Induktion von cAMP um 88,1 %, während bei 9F9C7 mAb (66,8 %) eine signifikant geringere Hemmung beobachtet wurde.Beide mAbs hatten minimale Hemmwirkungen bei 0,25 µg/ml (14 % bzw. 12 %), die von den Hintergrundwirkungen eines Kontrollantikörpers vom Ratten-IgG-Isotyp nicht zu unterscheiden waren.Der 7A12B3-mAb hemmt wirksam CTX-induzierte cAMP-Spiegel in Caco2-Zellen.(A) Die inhibitorischen Wirkungen der mAbs 7A12B3 und 9F9C7 (0,25–1,0 μg/ml) auf CTX-induziertes cAMP wurden unter Vorinkubation der mAbs mit CTX (0,5 μg/ml) für 20 Minuten bewertet.Der 7A12B3-mAb (1,0 μg/ml) hemmte CTX-induzierte cAMP-Spiegel in Caco2-Zellen stark, während 9F9C7 bei derselben Konzentration verringerte inhibitorische Wirkungen hatte.****p < 0,0001, **p < 0,01, Einweg misst ANOVA mit multiplen Vergleichstests von Bonferroni.Der Einschub zeigt eine Standardkurve von cAMP mit einer nichtlinearen Regressionsanalyse (GraphPad Prism 9), die zur Bestimmung der cAMP-Werte in Proben verwendet wurde.(B) Konzentrationsabhängige Hemmung von CTX (0,5 μg/ml)-induzierten cAMP-Spiegeln in Caco2-Zellen durch 7A12B3- und 9F9C9-mAbs.*p < 0,05, **p < 0,01, ANOVA mit Zweiwegmessungen mit Mehrfachvergleichstests von Bonferroni.Daten aus zwei unabhängigen Experimenten.Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Proben.Eine durchflusszytometrische Analyse wurde durchgeführt, um die Nützlichkeit von 7A12B3- und 9F9C7-mAbs zum Nachweis von CTB und seinen an die Oberfläche von Zielzellen gebundenen Varianten zu bewerten.Obwohl 7A12B3 in der Lage war, EPICERTIN auf der Oberfläche von Caco2-Epithelzellen nachzuweisen, zeigte 9F9C7 eine überlegene Nachweisbarkeit mit erhöhtem Fluoreszenzsignal bei der gleichen verwendeten Konzentration ( 6A , linkes Feld).Somit wurde der letztgenannte mAb in der weiteren Analyse verwendet.Der mAb 9F9C7 weist EPICERTIN, aber nicht EPICERTING33D nach, das an die Oberfläche der menschlichen Caco2-Zelllinie und an Milzleukozyten der Maus gebunden ist.(A) Durchflusszytometrieanalyse der EPICERTIN-Bindung an Caco2-Zellen, nachgewiesen mit 2 µg/ml 7A12B3- oder 9F9C7-mAbs, gefolgt von FITC-markiertem Ziegen-Anti-Ratten-IgG (linkes Feld).Nachweis der Bindung von EPICERTIN, CTB und EPICERTING33D (2 µg/ml) an die humane Caco2-Zelllinie, nachgewiesen mit Anti-CTB 9F9C9 mAb (rechtes Feld).(B) Färbemuster und abgegrenzte Milzleukozyten, die mittels Durchflusszytometrie auf EPICERTIN- und EPICERTING33D-Bindung gescreent wurden.Milzleukozyten wurden mit 5 μg/ml EPICERTIN oder EPICERTING33D für 30 Minuten auf Eis inkubiert und dann mit einer Reihe von Fluorochrom-markierten Antikörpern und FITC-konjugiertem 9F9C7-Anti-CTB-mAb gefärbt.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMed.Ther.Erw.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarNat.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarKlin.Erw.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarEUR.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarErw.Ther.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle 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